快速無(wú)菌檢測(cè)儀在生物制藥領(lǐng)域的發(fā)展與應(yīng)用

 近年來(lái)，隨著一些創(chuàng)新藥物的出現(xiàn)，經(jīng)典方法已不能很好地適應(yīng)新形勢(shì)新情況。CAR-T 細(xì)胞為近年來(lái)創(chuàng)新藥物中的明星品種，是一種特異性細(xì)胞免疫治療，將患者自體T 細(xì)胞通過(guò)基因修飾加上腫瘤特異性的嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)，使得被修飾的T細(xì)胞能夠靶向識(shí)別腫瘤細(xì)胞并對(duì)其進(jìn)行攻擊，從而起到治療目的。

與傳統(tǒng)無(wú)菌生物制品相比，CAR-T 細(xì)胞制品在質(zhì)量屬性和無(wú)菌生產(chǎn)工藝上存在諸多特殊性，其個(gè)體差異大、產(chǎn)量少、效期短、臨床需求緊迫，終產(chǎn)品需要快速放行；而在生產(chǎn)過(guò)程中，因細(xì)胞本身無(wú)法過(guò)濾除菌，無(wú)菌生產(chǎn)工藝要求更高，對(duì)過(guò)程控制要求也更高。在這類創(chuàng)新藥物工藝的近實(shí)時(shí)控制和成品快速放行中，耗時(shí)的傳統(tǒng)質(zhì)控方法顯然已不適用，需尋求快速、微量的新方法。這些新方法不少是源自基礎(chǔ)科研、臨床等領(lǐng)域，最初并非按制藥業(yè)的要求開發(fā)，因此需要經(jīng)過(guò)評(píng)價(jià)驗(yàn)證，證明其性能不劣于藥典法定方法后，才能用于創(chuàng)新藥物的質(zhì)量控制。

無(wú)菌檢測(cè)是產(chǎn)品質(zhì)量是細(xì)胞治療等領(lǐng)域保證的關(guān)鍵檢測(cè)項(xiàng)目?；谥袊?guó)藥典的無(wú)菌檢查法需要?dú)v經(jīng)14天，并且培養(yǎng)期間需要逐日觀察，經(jīng)過(guò)肉眼判讀后記錄結(jié)果。具有周期長(zhǎng)、手工環(huán)節(jié)多、人為因素影響大、數(shù)據(jù)完整性欠缺等不足。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，藥品或治療產(chǎn)品的種類也逐漸豐富起來(lái)，尤以短效期藥品和細(xì)胞治療產(chǎn)品的出現(xiàn)，將無(wú)菌檢測(cè)的時(shí)間和準(zhǔn)確性提高到了一個(gè)新的高度，伴隨著藥品記錄與數(shù)據(jù)管理規(guī)范的加強(qiáng)，數(shù)據(jù)完整性也成為不可忽視的一個(gè)問(wèn)題，這些問(wèn)題的出現(xiàn)給質(zhì)量控制部門帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)。

2010 年后，各國(guó)藥典針對(duì)微生物檢驗(yàn)替代方法的評(píng)價(jià)和驗(yàn)證推出了一系列指導(dǎo)原則，但在傳統(tǒng)制藥領(lǐng)域，快速替代方法的探索實(shí)例相對(duì)較少，而實(shí)際應(yīng)用于上市產(chǎn)品的案例目前更屬罕見，業(yè)內(nèi)經(jīng)驗(yàn)積累較少；但隨著創(chuàng)新藥品上市，這些快速替代方法將會(huì)得到廣泛應(yīng)用。

藥品無(wú)菌檢查是藥品質(zhì)量中對(duì)微生物*的最高要求，任何微生物的存活對(duì)于用藥者而言都可能是致命的。近年來(lái)屢屢曝出的藥害事件也使無(wú)菌制劑的無(wú)菌保障問(wèn)題成為公眾關(guān)注的焦點(diǎn)。藥典(1953 年版)就收載了無(wú)菌檢查法，在以后的歷次藥典改版中，對(duì)培養(yǎng)基種類及質(zhì)量要求、樣品的分類及檢驗(yàn)量、檢驗(yàn)方法等均進(jìn)行了不斷改進(jìn)。目前，無(wú)菌檢查法仍采用逐日觀察，培養(yǎng)14 d。根據(jù)培養(yǎng)管渾濁產(chǎn)生的情況判定樣品是否合格，在執(zhí)行過(guò)程中存在一些問(wèn)題，如逐日觀察的規(guī)定會(huì)導(dǎo)致無(wú)法及時(shí)發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，無(wú)菌檢查的檢驗(yàn)結(jié)果均為實(shí)驗(yàn)人員手工記錄，實(shí)驗(yàn)結(jié)果缺乏一定的可追溯性等。當(dāng)前，商品化的快速微生物檢查法(RMM)以其快速、操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確和檢測(cè)結(jié)果的可追溯等優(yōu)點(diǎn)，充分滿足了質(zhì)量保證所提出的更高要求，同時(shí)，也為過(guò)程分析技術(shù)(PAT)的實(shí)現(xiàn)提供了技術(shù)上的支撐。

為了適應(yīng)技術(shù)發(fā)展的需要，中國(guó)藥典也于2010年版在指導(dǎo)原則中收載了替代方法驗(yàn)證的有關(guān)內(nèi)容。相關(guān)的規(guī)范性文件的出臺(tái)為快速微生物檢查法的評(píng)價(jià)提供了理論依據(jù)和指南支持。

符合中國(guó)藥典中無(wú)菌檢測(cè)替代方法：【9201 藥品微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則】

解決問(wèn)題

1.  自動(dòng)化每10分鐘檢測(cè)一次，24小時(shí)連續(xù)監(jiān)測(cè)

2.  90%陽(yáng)性標(biāo)本可在12小時(shí)內(nèi)被檢測(cè)

3.  99%的陽(yáng)性標(biāo)本可在36小時(shí)內(nèi)可檢測(cè)

4.  平均檢出時(shí)間小于10小時(shí)

5.  假陽(yáng)性率小于0.1%

6. 由傳統(tǒng)的14天降低到4天

7. 一個(gè)CFU的微生物可以被檢測(cè)出

9201 藥品微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則有以下4個(gè)方面。

目前有兩家快速無(wú)菌檢測(cè)系統(tǒng)已經(jīng)被FDA 批準(zhǔn)用于細(xì)胞治療藥物以及基因治療藥物。在國(guó)內(nèi)，該系統(tǒng)也被用于是否為商業(yè)無(wú)菌產(chǎn)品的檢驗(yàn)，全血及成分血的無(wú)菌試驗(yàn)[，以及臨床血液、無(wú)菌體液的病原學(xué)診斷參照中國(guó)藥典2010 版附錄藥品微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則的有關(guān)內(nèi)容，分別考察專屬性、檢測(cè)限、重復(fù)性以及耐用性這4 個(gè)方面與現(xiàn)行版中國(guó)藥典無(wú)菌檢查法相比是否存在差異。

評(píng)價(jià)對(duì)于單一品種無(wú)菌檢查采用快速無(wú)菌檢測(cè)系統(tǒng)替代藥典無(wú)菌檢查法的可行性，為該方法作為產(chǎn)品放行檢驗(yàn)和過(guò)程控制的技術(shù)手段提供依據(jù)。藥典方法和替代方法實(shí)現(xiàn)嚴(yán)格厭氧環(huán)境的原理是不同的，前者是通過(guò)化學(xué)手段，而后者是物理手段。因此，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，對(duì)于嚴(yán)格厭氧菌的檢查，替代方法在操作過(guò)程中需要保證操作環(huán)境的嚴(yán)格厭氧。實(shí)驗(yàn)考察了替代方法在2 種操作環(huán)境下(普通生物安全環(huán)境和嚴(yán)格厭氧環(huán)境)，生孢梭菌的專屬性試驗(yàn)結(jié)果。試驗(yàn)結(jié)果表明，就培養(yǎng)體系促生長(zhǎng)試驗(yàn)來(lái)看，操作環(huán)境是否嚴(yán)格厭氧對(duì)于測(cè)定結(jié)果沒(méi)有影響，但對(duì)于樣品存在的專屬性試驗(yàn)結(jié)果影響則十分顯著。分析原因，由于樣品存在的專屬性試驗(yàn)需要接種10 mL的樣品，在普通操作環(huán)境下導(dǎo)入的氧氣量會(huì)明顯增多，由于操作環(huán)境沒(méi)有隔絕氧氣，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響就會(huì)凸顯出來(lái)，而當(dāng)接種量較少時(shí)，比如培養(yǎng)體系促生長(zhǎng)試驗(yàn)，這種影響就會(huì)被弱化。因此，在進(jìn)行樣品檢測(cè)時(shí)，需在厭氧的環(huán)境下接種樣品至厭氧瓶，保證嚴(yán)格厭氧菌能被有效檢出。驗(yàn)證結(jié)果表明，替代方法與藥典方法基本相當(dāng)。但是驗(yàn)證試驗(yàn)不可能覆蓋所有的微生物，由于2 種方法的培養(yǎng)基體系不*相同，因此不能排除對(duì)于某些微生物的促生長(zhǎng)能力2 種方法可能不相當(dāng)。

BD BACTEC FX40 儀器是一種用于檢測(cè)臨床樣本中是否存在微生物的自動(dòng)系統(tǒng)。已植入的瓶放在儀器瓶位中。門關(guān)閉后，將通過(guò)瓶中專門設(shè)計(jì)的傳感器測(cè)量熒光水平，從而監(jiān)控瓶中微生物代謝活動(dòng)隨時(shí)間的變化情況。此操作由測(cè)量子系統(tǒng)執(zhí)行。算法子系統(tǒng)分析測(cè)量子系統(tǒng)發(fā)出的信號(hào)以確定是否存在微生物生長(zhǎng)（即陽(yáng)性）證據(jù)。攪拌操作由支持有機(jī)體生長(zhǎng)的攪拌子系統(tǒng)執(zhí)行。數(shù)據(jù)存儲(chǔ)和檢查通過(guò)數(shù)據(jù)管理子系統(tǒng)進(jìn)行管理。如果發(fā)生孵化失敗、攪拌故障或測(cè)量系統(tǒng)故障等警報(bào)條件，瓶位將顯示為不可用。

用戶界面子系統(tǒng)包括與儀器工作流程有關(guān)的所有儀器功能：首先將瓶插入到儀器中進(jìn)行測(cè)試、然后移除陽(yáng)性瓶，最后移除陰性瓶?？梢韵蛳到y(tǒng)中輸入統(tǒng)計(jì)信息并以報(bào)告形式輸出?？梢酝ㄟ^(guò)專為單手操作而設(shè)計(jì)的條形碼閱讀器輸入瓶信息，也可以通過(guò)屏幕鍵盤手動(dòng)輸入。通過(guò)在對(duì)瓶進(jìn)行掃描后立即將該瓶插入到瓶位，可以將瓶與特定的瓶位相關(guān)聯(lián)；這會(huì)激活瓶位的瓶駐留傳感器。您可以查看由儀器處理的瓶的相關(guān)信息、請(qǐng)求打印報(bào)告或與 EpiCenter 系統(tǒng)通信。儀器前面的 LED 指示燈和每個(gè)瓶位上方的其他指示燈可傳遞狀況信息。每個(gè)工作流程事務(wù)完成時(shí)，儀器會(huì)提供確認(rèn)性的音頻和視頻反饋。

可以將 1 至 4 個(gè) BACTEC FX40 儀器連接到單個(gè)平板電腦上，并可以共享一臺(tái)打印機(jī)和條形碼閱讀器。此群集可以連接到一個(gè) BD EpiCenter 系統(tǒng)以形成一個(gè)在 BACTEC FX40 群集和 BACTEC FX 儀器之間具有*連接的更大安裝。

快速無(wú)菌檢測(cè)系統(tǒng)采用簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)接、連續(xù)震蕩孵育檢測(cè)技術(shù)，降低了無(wú)菌操作污染的風(fēng)險(xiǎn)，實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)結(jié)果及時(shí)反饋，區(qū)別于傳統(tǒng)無(wú)菌檢查的繁瑣操作、靜態(tài)培養(yǎng)以及人為的濁度判讀法，有其結(jié)果報(bào)告的實(shí)時(shí)性、可追溯性以及避免人員干擾的優(yōu)勢(shì)。

替代方法和藥典方法無(wú)菌檢查都是基于培養(yǎng)的，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否為“無(wú)菌生長(zhǎng)"在一定程度是基于標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的培養(yǎng)天數(shù)，也就是說(shuō)14 d“無(wú)菌生長(zhǎng)"并不一定意味著15 d 仍是“無(wú)菌生長(zhǎng)"。因此，縮短無(wú)菌檢查的培養(yǎng)天數(shù)是有風(fēng)險(xiǎn)的。通過(guò)替代方法的驗(yàn)證試驗(yàn)，可以認(rèn)為快速無(wú)菌檢測(cè)系統(tǒng)作為某一具體品種用于過(guò)程控制是可行的。

參照 2015 年及 2020 年版中國(guó)藥典四部通則<9201>藥品微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則的有關(guān)內(nèi)容，對(duì) BACTEC FX 全自動(dòng)系統(tǒng)與中國(guó)藥典的無(wú)菌檢查法進(jìn)行了系統(tǒng)比較。同時(shí)選取特定品種，全面評(píng)估 BACTEC FX 全自動(dòng)系統(tǒng)與中國(guó)藥典的無(wú)菌檢查法在專屬性、檢測(cè)限、重復(fù)性以及耐用性是否存在差異。為該品種是否能采用 BACTEC FX 全自動(dòng)系統(tǒng)進(jìn)行無(wú)菌快速檢測(cè)提供依據(jù)。

注：文章摘自當(dāng)前發(fā)布的文獻(xiàn)，歡迎咨詢。